Teknologi Reproduksi
KRIOPRESERVASI EMBRIO
HEWAN TERNAK
KELOMPOK
5,
KELAS
C
ANGGOTA KELOMPOK:
HESTY
HARDIANTY 1202101010057
KHAIRUL
RIZAL 1202101010058
ZIAN
ULFATURRIZA 1202101010067
M.
RIDHAN AKBAR 1202101010086
TEUKU
SADIQ ROSA 1202101010088
FUJI
NUHRAINI 1202101010
Fakultas
Kedokteran Hewan
Universitas
Syiah Kuala
Banda
Aceh
2014
KRIOPRESERVASI EMBRIO HEWAN TERNAK
Secara teoritis, kriopreservasi berasal dari kata krio yang berarti
beku, dan preservasi yang berarti penyimpanan pada temperatur rendah. Jadi
kriopreservasi adalah teknik penyimpanan materi genetik dalam keadaan beku pada
temperatur rendah atau suatu teknik penyimpanan sel hewan, tumbuhan dan materi
genetika lainnya (termasuk semen dan oosit) dalam keadaan beku melalui reduksi
aktivitas metabolisme tanpa mempengaruhi organel-organel di dalam sel, fungsi
fisiologi, biologi, dan morfologi.
Kriopreservasi adalah suatu
proses penghentian untuk sementara kegiatan hidup dari sel
tanpa mematikan fungsi sel, dimana proses hidup dapat berlanjut setelah
pembekuan dihentikan.Teknik kriopreservasi pada berbagai sel, jaringan, dan
organ telah banyak dilakukan, demikian juga dengan kriopreservasi embrio. Salah
satu cara penyediaan
embrio yang telah banyak dilakukan adalah
pengawetan dengan metode freezing atau pembekuan
dengan cara slow freezing,
rapid freezing, dan
ultra rapid freezing.
Namun, saat ini telah dikembangkan
pembekuan embrio dengan metode vitrifikasi
yang lebih mudah dilakukan dan jauh lebih sederhana.
Secara
umum, mekanisme kriopreservasi merupakan perubahan bentuk fisik timbal balik
dari fase cair ke padat dan kembali lagi ke fase cair. Mekanisme fisika kriopreservasi
meliputi penurunan temperatur pada tekanan normal disertai dengan dehidrasi
sampai tingkat tertentu dan mencapai temperatur jauh di bawah 0oC
(-196 oC). Proses ini harus reversibel ke kondisi fisiologis awal.
Tujuan kriopreservasi adalah mempertahankan sesempurna mungkin sifat-sifat
material biologis terutama viabilitasnya.
PRINSIP KRIOPRESERVASI
Pengeluaran
sebagian besar air dari sel-sel sebelum terjadinya pembekuan, sehingga terjadi
penurunan volume air dalam sel, perubahan air menjadi es, dan peningkatan
konsentrasi larutan di dalam dan di luar sel .
Metode
Secara umum terdapat dua metode pembekuan yang
telah dikembangkan, yaitu metode kriopreservasi
konvensional dan metode vitrifikasi.
Metode konvensional
Metode konvensional sangat menekankan pada pembekuan lambat,
sehingga berpeluang besar terbentuk kristal es. Metode ini memerlukan alat
pembekuan terprogram untuk mengatur proses dehidrasi sel dan
kecepatan pembekuan.
a) Step by step freezing method (SLOW
FREEZING)
Tahap
pemaparan krioprotektan, baik pada waktu penambahan krioprotektan pra pembekuan
maupun pada saat pembekuan dan pembilasan dilakukan secara bertahap .
b) Two step
freezing method
Tahap
pemaparan dilakukan bertahap sama seperti step by step method, tetapi penurunan
suhu langsung dari suhu kamar ke suhu pluging ( - 35 oC) selama 10 menit selanjutnya benamkan dalam
suhu – 196 oC
c) Rapid
freezing method
Tahap
pemaparan sama dengan metode step by step, tetapi suhu dari suhu kamar di
turunkan ke 4 oC, kemudian dinginkan pada kabut nitrogen selama 10
menit, selanjutnya celupkan dalam lart. nitrogen cair ( -196 oC)
d) Ultrapid
freezing method
Tahap
pemaparan sama dengan metode step by step, tetapi suhu dari suhu kamar di
turunkan ke 4 oC selama 10 – 20 menit , kemudian langsung dicelupkan dalam
lart. nitrogen cair ( -196 oC)
Metode vitrifikasi
Metode vitrifikasi, pembekuan embrio dilakukan secara cepat pada
temperatur -196 oC dengan menggunakan krioprotektan konsentrasi tinggi sehingga dapat
menghindari terbentuknya kristal es yang dapat merusak membran
sel saat pembekuan. Pembekuan
embrio dengan metode ini dapat dilakukan dengan lebih murah (tidak diperlukan
peralatan yang mahal), prosedur yang mudah, dan cepat
Prosedur Vitrifikasi
Equilibrasi dan pemaparan embrio
dengan medium krioprotektan intraselluler
–
Medium krioprotektan intraselluler mengandung 10%
gliserol – 20% 1.2. propanodiol dalam PBS. Embrio dipapar dalam medium tersebut
pada temperatur kamar selama 10 menit equilibrasi
Pembekuan;
–
Setelah pemaparan dengan medium krioprotektan
intraselluler, embrio dipindahkan ke medium vitrifikasi ekstraselluler yang
terdiri dari atas 25 % gliserol dan 25 % 1.2 propanediol dalam PBS dan siap
dikemas dalam straw
–
Segera setelah pengemasan ministraw langsung
dicelupkan dalam nitrogen cair secara progresif untuk menghindari letupan
kristal es sukrosa yang dapat memecahkan straw
Pencairan dan Pembilasan
krioprotektan
–
Pencairan dilakukan dengan cara memasukan ministraw
ke dalam waterbath 30 oC sampai kristal es dalam diluen hilang.
Segera setelah hangat seluruh isi straw dikeluarkan ke dalam petridish, biarkan
10 menit equilibrasi pada suhu 37 oC, kemudian embrio dipipet untuk
pencucian tiga kali dalam PBS 20 % h.i FCS
Teknik Kriopreservasi
Teknik kriopreservasi dapat dibedakan atas teknik
lama (klasik) dan teknik baru :
A. Teknik lama (klasik)
Teknik ini didasarkan pada freeze-induced dehydration, yaitu dehidrasi yang
diinduksi dengan pembekuan pada suhu di bawah titik beku air hingga -40°C.
Teknik lama juga disebut teknik pembekuan lambat atau teknik pembekuan dua
tahap. Teknik pembekuan dua tahap meliputi inkubasi sel pada krioprotektan
dengan total konsentrasi 1-2 M yang menyebabkan dehidrasi moderat dan diikuti
oleh pembekuan lambat, misalnya dengan kecepatan 1°C per menit hingga suhu
-35°C, lalu pembekuan dalam nitrogen cair dan selanjutnya thawing (pelelehan) .
B. Teknik baru
Teknik ini didasarkan pada vitrification, yaitu dehidrasi yang diinduksi pada suhu
di atas titik beku air.Vitrification (vitrifikasi)
adalah fase transisi air dari bentuk cair menjadi bentuk nonkristalin
atau amorf, tembus pandang (glassy) karena
elevasi ekstrim dari larutan yang viskos selama pendinginan. Teknik vitrifikasi
didasarkan pada dehidrasi sel pada suhu non-freezing (tidak
beku), yaitu dengan merendam bahan dalam larutan krioprotektan dengan total
konsentrasi 5-8 M pada suhu 0-25°C dan diikuti oleh pembekuan dan selanjutnya
pelelehan. Macam-macam teknik baru antara lain (1) vitrifikasi, (2) enkapsulasidehidrasi,
(3) enkapsulasi-vitrifikasi, (4) desikasi, (5) pratumbuh, (6)
pratumbuh-desikasi, dan (7) dropplet-freezing .
Adapun penjelasannya sebagai berikut:
a)
Pada teknik vitrifikasi, bahan diperlakukan dengan senyawa krioprotektif dan dehidrasi
dengan larutan vitrifikasi, lalu diikuti dengan pembekuan cepat, pelelehan, dan
pembuangan krioprotektan serta pemulihan kultur.
b)
Teknik enkapsulasidehidrasi didasarkan pada teknologi yang telah dikembangkan
pada produksi benih sintetik. Pada teknik tersebut, bahan dienkapsulasi pada
kapsul alginat, lalu ditumbuhkan pada medium yang diperkaya dengan sukrosa dan
dikeringkan secara parsial dalam laminar air flow cabinet atau gel silika
hingga kandungan air sekitar 20% dan diikuti oleh pembekuan cepat .
c)
Teknik enkapsulasi-vitrifikasi merupakan kombinasi antara teknik vitrifikasi
dan enkapsulasidehidrasi, yaitu bahan dienkapsulasi dengan kapsul alginat, lalu
dibekukan dengan teknik vitrifikasi.
d)
Teknik desikasi merupakan teknik yang paling sederhana, yaitu mengeringkan
bahan dalam laminar air flow cabinet, gel
silika atau flash drying hingga kandungan
air 10-20%, kemudian diikuti oleh pembekuan cepat .
e)
Teknik pratumbuh meliputi penanaman bahan ke dalam media yang mengandung krioprotektan,
lalu diikuti oleh pembekuan cepat.
f)
Teknik pratumbuh-desikasi dilakukan dengan menanam bahan ke dalam media yang
mengandung krioprotektan, lalu mengeringkannya dalam laminar air flow cabinet atau gel silika dan
diikuti oleh pembekuan cepat.
g)
Droplet-freezing diawali dengan pra-perlakuan
bahan ke dalam media cair yang mengandung krioprotektan, lalu meletakkan pada
Al-foil yang disertai dengan droplet krioprotektan dan diikuti oleh pembekuan
cepat .
Teknik lama memerlukan peralatan terprogram yang cukup mahal harganya,
sedangkan teknik baru tidak memerlukan peralatan canggih dan prosedurnya
relatif lebih mudah. Teknik lama memerlukan peralatan pembekuan, digunakan pada
kultur sel, dan lebih sulit diaplikasikan pada unit sel yang lebih besar
seperti tunas apikal atau embrio. Teknik lama berhasil diterapkan pada sistem
kultur yang tidak terdiferensiasi (suspensi sel dan kalus) dan spesies yang
toleran terhadap suhu dingin, namun tidak berhasil diterapkan pada spesies tropis.
Teknik vitrifikasi telah berhasil diterapkan pada spesies dengan skala yang
lebih luas (tropis dan subtropis) dan sistem kultur yang lebih kompleks
(embriosomatik, suspensi sel, dan meristem apikal)
MEKANISME
KRIOPRESERVASI
q Merupakan
perubahan bentuk fisik timbal balik dari fase cair ke fase padat (fase beku)
dan kembali ke fase cair
q Mekanisme
Fisik Kriopreservasi ini meliputi;
§ Penurunan
temperatur dalam keadaan tekanan normal disertai dengan dehidrasi sampai
tingkat tertentu dan mencapai temperatur deepfreezing
§ Proses
ini harus revelsibel ke keadaan fisiologis
§ Tujuannya
mempertahankan sesempurna mungkin sifat-sifat meterial biologis, terutama
viabilitasnya
Hal penting terkait keberhasilan pembekuan embrio
Keberhasilan pembekuan embrio
tergantung dari jenis embrio melalui upaya manipulasi media (krioprotektan), percepatan derajat
pendinginan, pengaturan suhu selama pemaparan, pendinginan, penyimpanan, dan pencairan. Dalam penyedian krioprotektan
yang harus diperhatikan adalah faktor konsentrasi.
Pengembangan kembali embrio yang telah dibekukan
Embrio yang telah dibekukan dapat
ditumbuh kembangkan kembali secara in vitro melalui metode kultur atau
secara in vivo melalui metode transfer embrio
Faktor-faktor yang menyebabkan sel mati karena
proses kriopreservasi
v Kerusakan
mekanis dengan timbulnya pembentukan kristal es intraselluler yang dapat
mempengaruhi struktur sel. Kerusakan dapat terjadi pada organel dalam
protoplasma
v Adanya
dehidrasi dalam suspensi media baik intra maupun ekstraselluler sehingga
konsentrasi solute menjadi toksik dan letal. Dehidrasi juga dapat menimbulkan
presipitasi, koagulasi, hancurnya struktur molekul, kenaikan permeabilitas dan
viskositas serta gangguan keseimbangan ion
v Perubahan-perubahan
fisik-kimiawi diantaranya presipitasi, denaturasi, koagulasi dari protein,
disosiasi ion dan kehilangan sifat-sifat adsorbtif ayau sifat pengikat air.
Klasifikasi embrio Pre Pembekuan
|
Kualitas
|
Penampilan umum morfologi
|
|
A (+++)
Sangat baik
|
Stadium embrio sesuai dengan yang diantisifasi ( morula,
blastosis awal, blastosis ) tidak cacat, zona intak, bentuk bundar sperikal,
ikatan antar blastomer erat dan kompak, ukuran sama besar dan simetris, warna
agak gelap dan morfologi sel yang utuh
|
|
B ( ++ ) Baik
|
Stadum perkembangan agak retarded banding dengan sekelompok embrio yang
terkoleksi bersama tampak sdikit cacat, seperti keluarnya salah satu
blastomer dari ikatan kumpulan blastomer, bentuk simetris,
|
|
C ( + ) Cukup
|
Staium perkembangan biasanya retarded , Cacat
bebrapa blastomer keluar, mulai berdegenerasi dan berwarna pucat, ukuran
blastomer tidak sama besar atau asimetris
|
|
D ( - ) Jelek
|
Stadium perkembagan retarded , terlihat kerusakan
pada semua sel blastomer, sel blastomer sudah mengalami degenerasi seluler
seperti vakuolisasi, granulasi dan debris, sedikit atau tidak ada sama sekali organisasi sel dan zona pellusida tampak retak
|
Klasifikasi embrio Pasca Pembekuan
|
Kualitas
|
Penampilan umum morfologi
|
|
A (+++)
Sangat baik
|
Embrio masih seperti segar, tidak dapat dibedakan
dari embrio yang belum dibekukan
|
|
B ( ++ ) Baik
|
Lebih gelap dari normal, masih memiliki ukuran dan
bentuk seperti embrio segar
|
|
C ( + ) Cukup
|
Tampak jelas lebih gelap dan lebih kecil dari
normal, material yang gelap keluar dari massa sel, vesikuler, inclusion
tampak jelas, zona kelihat retak dengan batas jelas atau kabur
|
|
D ( - ) Jelek
|
Warna gelap, bentuk irreguler, 1 atau beberapa
masa hitam kecil, granular, vesiculer inclusion keluar besar, zona retak dan
bentuk irreguler, blastomer mebran kabur, kadang kala blastomer bulat tetapi
tidak saling melekat dengan blastomer sekitarnya
|
|
E ( mati ) dead
|
Biasanya bentuk irreguler, zona rusak berat,
blastomer-blastomer terlalu terang atau gelap, bentuk embrio irregular karena
sering kehilangan bagian luar membran, masa sitoplasma sangat sedikit dan
tidak ada organisasi sel dengan jarak yang jauh dalam sitoplasma
|
KEUNTUNGAN
KRIOPRESERVASI EMBRIO
• Embrio
dapat disimpan dalam jangka waktu tidak terbatas
• Embrio
dapat dikoleksi sepanjang tahun dan ditransperkan pada musim-musim kawin
• Surplus
embrio dapat disimpan dan ditransferkan pada resifien yang akan tersedia
• Jenis-jenis
embrio yang berada dalam ambang kepunahan dapat dipreservasi atau pelestarian
plasma nutfah
• Sebagian
embrio dapat dibekukan dan ditransferkan
KERUGIAN
KRIOPRESERVASI EMBRIO
• Biaya
tambahan untuk peralatan pembekuan dan tenaga teknisi terlatih, trampil untuk
mengoperasikan alat
• Hanya
embrio yang berkualitas bagus yang cocok dan dapat dibekukan
• Sekitar
1/10 embrio beku yang telah dicairkan akan mengalami kerusakan berat karena
alasan kriopreservasi.
KESIMPULAN
Kriopreservasi embrio adalah suatu proses penghentian untuk
sementara kegiatan hidup dari sel tanpa
mematikan fungsi sel, dimana proses hidup dapat berlanjut setelah pembekuan
dihentikan. Secara umum
terdapat dua metode pembekuan yang telah dikembangkan, yaitu metode kriopreservasi konvensional dan metode vitrifikasi.
Secara umum, mekanisme kriopreservasi merupakan perubahan
bentuk fisik timbal balik dari fase cair ke padat dan kembali lagi ke fase
cair. Mekanisme fisika kriopreservasi meliputi penurunan temperatur pada
tekanan normal disertai dengan dehidrasi sampai tingkat tertentu dan mencapai
temperatur jauh di bawah 0oC (-196 oC). Proses ini harus
reversibel ke kondisi fisiologis awal. Tujuan kriopreservasi adalah
mempertahankan sesempurna mungkin sifat-sifat material biologis terutama
viabilitasnya.
Adapun
keuntungan kriopreservasi embrio ialah embrio dapat disimpan dalam jangka waktu
tidak terbatas , embrio dapat dikoleksi sepanjang tahun dan ditransperkan pada
musim-musim kawin , surplus embrio dapat disimpan dan ditransferkan pada
resifien yang akan tersedia, jenis-jenis embrio yang berada dalam ambang
kepunahan dapat dipreservasi atau pelestarian plasma nutfah, sebagian embrio
dapat dibekukan dan ditransferkan.
Kerugian
kriopreservasi embrio ialah biaya tambahan untuk peralatan pembekuan dan tenaga
teknisi terlatih, trampil untuk mengoperasikan alat, hanya embrio yang
berkualitas bagus yang cocok dan dapat dibekukan, sekitar 1/10 embrio beku yang
telah dicairkan akan mengalami kerusakan berat karena alasan kriopreservasi.
DAFTAR
PUSTAKA
pada
tanggal 2 Desember 2014
Fulton,
J.E. 2006. Avian genetic stock preservation: Anindustry perspective.
Poult. Sci. 85: 227 – 231
Rall, W.F. 1992. Cryopreservation
of oocytes and embryos : methods and application Ani. Repord, Sci., 28 :
237 - 245.
Suprianata,
I. dan F.H. Pasaribu. 1992. In Vitro Fertization, Transfer
Embrio dan Pembekuan Embrio.
Bogor
: IPB
Tidak ada komentar:
Posting Komentar